由於血細胞分析儀具有快速、準確和便捷等優勢，60多年來一直在改變實驗室血常規檢驗方法與檢驗流程。近年來血細胞分析儀由於各種新技術的使用，其檢測性能越來越強大，檢測參數也越來越多，特別是具有白細胞五分類技術的儀器的普及應用及全自動流水線化的血細胞分析系統的使用，使得實驗室越來越依賴這樣的設備來完成大量的血常規檢驗工作[1]。
在樣本量加大和人員缺乏這種特定環境條件下，外周血塗片檢查的重要性被逐漸淡化和忽視，以至造成一些漏診與錯誤。這種現象已經引起國內外臨床檢驗界的重視，因此P.W.Barnes等教授倡導並組成了國際血液學複檢專家組（International Consensus Group for hematology Review），並在2005年制定了自動血細胞計數和白細胞分類計數的複檢標準[2]，該標準被國際實驗血液學學會（ISLH）作為一個推薦方法介紹給全球使用各種自動化血液分析系統的專業人士參考。
中華醫學會檢驗分會也於2006年組成全國血液學複檢專家小組對該標準進行了標準的釋義並將其發表[3]，這就是我們所熟悉的41條篩檢規則。而採用不同的血細胞分析系統，建立與各自醫療單位和服務人群相適應的複檢規則也成為血液分析儀的用戶單位的重要工作，這也是衛生部實驗室管理辦法和ISO 15189評審中重要的檢查條款。
在應用各種血液細胞自動化分析設備時，複查和複檢很重要，我們應該從下面幾點進行複查或者複檢，及時發現問題。
重視樣本性狀的篩查
進行血細胞分析複檢時，首先應該關註標本的性狀非常重要。明顯影響檢測結果的問題包括：標本採集量是否符合要求，血液標本凝集或有凝塊，乳糜血或脂血，冷凝集現象或冷球蛋白，溶血，高白細胞血症，高膽紅素血症等。
1、標本採集量：如果使用真空采血管，採用真空采血模式，一般不會出血採集量差異太大的情況。但遇到抽血困難，或許有採集量不足問題。此時應與臨床溝通，確認檢驗結果是否受到影響，如果沒有受到影響，採用讓步檢驗的模式發放報告，並備註說明採集量問題。如果用注射器採集後注入采血管內，會發生採集量不準，過少或者過多。過多時可能造成抗凝劑與血液比例不適，導致抗凝不充分，從而影響血小板及其他指標的檢測結果，此時應做不合格標本處理。
2、凝血標本：通過肉眼觀察可以發現標本已經凝血；搖動試管可以發現試管內有大小不同的凝塊；打開試管帽可見管帽內存有凝塊；用長竹籤或施工攪動標本或吸取，用於發現肉眼沒有發現的凝塊或纖維蛋白凝絲。此類標本可判定為不合格，應予拒收退回。
3、乳糜血或脂血：通過自然沉澱或離心沉澱，可發現乳糜血（圖1），乳糜血會導致光學法檢測的HGB測定結果不正確，進而影響MCH，MCHC計算結果，此時需採用離心置換血漿的模式排除干擾後再行測定HGB，或者採用光學法原理的儀器或功能測定HGB結果，並重新評估和計算MCH，MCHC。高脂血症肉眼不可發現，可通過LIS系統查詢生化檢測結果，再查看WBC分類散點圖，評估分類結果是否正確，必要時應採用顯微鏡分類法糾正白細胞分類結果。
4、冷凝集及冷球蛋白：嚴重的冷凝集現象肉眼可見試管壁出現細沙樣顆粒（圖2），弱冷凝集時可將標本置於4°C冰箱環境下3-5min，即可肉眼發現，也可將少許標本滴於玻片上在顯微鏡下查看。
冷凝集現象可導致紅細胞測定結果偏低，進而導致MCH，MCHC計算錯誤，MCV測定不準確，進而影響WBC計數不準確。應首先採用37°C水浴30~60min之後再行測定的方式解決。冷球蛋白極難發現，往往導致PLT結果假性升高，通過血塗片和散點圖異常可初步發現，最終需要通過免疫固定電泳或毛細管免疫分型結果來確定。此時PLT結果不可輕易發放，或許要經37°C水浴30~60min之後再行測定，排除冷球蛋白乾擾。
5、溶血：將標本離心可發現是否有溶血現象，如有溶血則可作為不合格標本拒收。
6、高白細胞血症：白血病患者白細胞往往會升高至100×109/L以上，一般認為當白細胞數量>200×109/L時會導致比色法HGB測定結果不正確，嚴重貧血患者甚至還會影響到RBC檢測結果的準確，進而影響MCH，MCHC計算結果的正確。
將標本沉澱一段時間就可以看到紅細胞層與血漿之間出現明顯的白細胞沉澱層（圖3）。可通過HGB、RBC、HCT之間的關係和MCH、MCHC的結果綜合判定分析，確認該血常規結果是否符合規則，一旦影響應減除白細胞數量對紅細胞的影響以及HGB受到的濁度干擾導致的錯誤，進行糾正後再發報告。高白細胞血症（特別是中性粒細胞）還可影響血糖檢測結果，導致其降低[10]，應及時與科室負責血糖檢測的同事進行溝通交流。
7、高膽紅素：高膽紅素可通過沉澱或離心法，觀察血漿顏色進行初判，更可通過LIS系統查閱血清Bil測定結果後判定。高膽紅素時會導致比色法的HGB結果偏高，進而導致MCH、MCHC計算結果不準確，也可通過這兩個計算參數的異常來評估標本是否受高膽紅素影響而導致偏高。如遇到此問題，可採用置換血漿的方法重新測定HGB結果，並糾正HCH、MCHC計算結果。
8、其他：包括標本採集錯誤，無條碼或標籤、標籤脫落、試管破裂、試管蓋未蓋緊導致標本滲漏等問題，應予以拒收。
顯微鏡塗片複檢
這一點很重要！血塗片的複檢與複核方法有兩種，血片瀏覽（review）和血片分類（differential）。許多情況下我們僅僅需要瀏覽複核血片，用於確認血細胞分析儀得出的結論，例如紅細胞體積大小（對發現的紅細胞異常形態、染色、內含物應同時進行描述和報告），大小不等、某類細胞增高或減低（不包括形態學報告內容）。對出現白細胞形態學提示的問題，分類不正確的問題、不能分類的問題，則應採用顯微鏡下血片分類，重新分類報告。
那麼複檢規則要關注和解決哪些問題呢？以下幾點建議供參考：
1、首先瀏覽血塗片，此時可採用低倍（或高倍）鏡瀏覽觀察，初步了解血塗片製片效果，細胞的分佈情況，染色效果，有否具有病理意義的大型細胞的出現等。如果是EDTA抗凝血，血小板應該分佈均勻，不應出現聚集現象，如有出現明顯的血小板聚集現象，特別是在玻片的兩端和尾部出現大片凝集時（圖4），將是導致儀器法計數血小板假性減低的重要原因，也是複檢時首先要關注的問題，也是檢驗科最不應該漏檢的內容。
觀察血片同時還需要觀察紅細胞的分佈與排列，發現緡錢狀排列現象和紅細胞凝集現象等，從而發現初步判斷是否有多發性骨髓瘤、巨球蛋白血症、血粘度較高或者冷凝集綜合征等，甚至考慮判斷是否會影響紅細胞計數的準確性等問題。
2、通過血塗片的瀏覽觀察，可以對血細胞分析儀測定的細胞計數結果進行複核，初步評估儀器計數結果的可靠性和一致性。例如白細胞可參考表1的關係進行複核[4]；或採用估算方法進行複核，選擇血片中分佈均勻的區域進行評估，白細胞計數（×109/L）=每高倍鏡視野中白細胞平均個數×2×109/L[5]。
還可根據血塗片上血小板分佈情況初步評估儀器對血小板計數結果的一致性及複核。如果每油鏡視野中平均1個血小板，相當於PLT計數結果的10×109/L，依次類推。或者通過血片推斷血小板數量，選擇血片體尾交界處分佈均勻、無異常聚集或纖維蛋白絲的區域，瀏覽血塗片可大致估算血小板數量，方法為：血小板數（×109/L）=每油鏡視野中血小板平均個數×15×109/L[5]。
3、複檢中很重要的問題是不要漏檢血液系統疾病（圖5、圖6），特別是血液系統腫瘤。雖然許多品牌的血細胞分析儀可以給出不成熟粒細胞（IG）、異型淋巴細胞（ATYP）、原始細胞（BLAST）、核左移（LEFT SHIFT）、大型未染色細胞（LUC）等提示性報警信息，甚至是數量結果信息，但是他們依然具有局限性。根據目前的技術水平，五分類原理的血細胞分析儀尚不能對多種異常細胞給出明確的定義，更談不上對血液系統疾病給出正確的白細胞分類報告。因此需要有經驗的檢驗醫師或技師進行細緻的顯微鏡分類複檢。
我們在進行顯微鏡塗片檢查時，除了關注和發現各系原始或幼稚細胞外，此外還應關注白細胞內的顆粒變化，如多顆粒中性粒細胞和少（乏）顆粒中性粒細胞；中性粒細胞毒性改變，如中毒顆粒（也稱多顆粒中性粒細胞）、空泡變性、Döhle小體及白細胞體積大小不均等；核左移與核右移；Pelger-Huet畸形(圖7)、May-Hegglin畸形、Chediak-Higashi畸形、是否吞噬病原微生物等現象。這些問題的出現對診斷傳染性疾病、某些嚴重感染、中毒、惡性腫瘤、猩紅熱、白喉、MDS等具有重要意義，還對疾病的治療和預後判斷具有一定的幫助。對嗜酸性、嗜鹼性和單核細胞異常增高的病例，也需進行鏡下複核與確認，以防止出現假性增加的問題。
此外還要觀察是否有其他異常細胞出現，如異型淋巴細胞、漿細胞、骨髓瘤細胞、毛細胞、塞色利（Sezary）細胞（圖8）、淋巴瘤細胞等，以便初步篩查某些血液系統疾病。白細胞參數出現異常報警提示，一般要考慮進行顯微鏡下的白細胞分類，將幼稚或異常的白細胞給出適當的百分比報告，對儀器分類錯誤的結果要給予糾正或重新分類確定。如果某些報警信息過於敏感，經鏡檢確認未見異常報警信息所提示的細胞、或未見異常細胞，也要在報告中予以記錄和說明。
4、應該關注紅細胞形態信息，提供貧血診斷的初步鑒別信息。一般血細胞分析儀都會提供許多紅細胞報警的信息，如大細胞（Macro）、小細胞（Micro）、紅細胞大小不等（Aniso）、血紅蛋白含量不均（HC VAR）、低色素性（Hypo）、高色素性（Hyper）等形態學信息。
作者認為這些紅細胞形態學信息是更加準確的告知一個樣本的紅細胞大小或大小不等的信息，他更加客觀、更加敏感，更加準確的、定量化的了解紅細胞大小及色素改變的情況，是比較可信的參數，而這些參數的準確性應該建立在儀器校準合格、儀器質控在控及MCV\MCH\MCHC三項浮動均值指標完全在控的基礎之上。而人工觀測和描述這些紅細胞信息，則可能受到個人經驗因素影響，作者認為其敏感性和一致性不如儀器分析結果準確和穩定。紅細胞大小及形態學改變的臨床意義參見表2。
紅細胞分析還可對一些現象進行提示性報警，如紅細胞聚集（RBC Agglutination）表示標本可能有冷凝集現象；HGB測定渾濁增加（HGB Interf）則可能是因乳糜血因素的影響；有核紅細胞增加（NRBC）、紅細胞雙峰分佈（Dimorphic Pobulation）、紅細胞碎片（RBC Fragment）干擾等，這些提示可以對一些紅細胞和血紅蛋白異常現象進行初步判斷，但是NRBC、紅細胞聚集、紅細胞碎片現象等還需要進行顯微鏡下的確認。如果這些現象出現，會影響到白細胞和紅細胞計數的正確性，進而影響紅細胞相關計算參數的準確性，因而需複檢血片；紅細胞碎片增多會干擾阻抗法的血小板計數結果，也要通過儀器直方圖和散點圖初篩，通過複檢血片而確認，並且需要對受到影響的計數結果進行糾正。
我們複檢血片所需要關注的是許多紅細胞形態的異常改變、染色情況和內部結構出現異常時，血細胞分析儀的有關參數和報警信息不能完全覆蓋或不能正確提示，如珠蛋白生成障礙性貧血和HbC時出現的靶形紅細胞；遺傳性橢圓形紅細胞增多症；自身免疫性溶血性貧血時的球形紅細胞（spherocyte）增多（圖9）；肝臟疾病、溶血性貧血和小兒消化系統疾病導致的口形紅細胞（stomatocyte）增加（圖10）；舞蹈病和重度肝損傷時的棘形紅細胞（acanthocyte）增多（11）、骨髓纖維化時的淚滴樣紅細胞（tear drop）、巨幼細胞貧血和橢圓形紅細胞增多症時的橢圓形紅細胞（elliptocyte）增加（圖12）；以及鐮狀細胞（sickle cell）貧血、嗜鹼性點彩（basophilic stippling）紅細胞、卡波環（Cabot rings）和豪焦小體（Howell-Jolly bodies）等情況出現和增加，均需要通過觀察紅細胞形態而進行識別和參與臨床輔助診斷。
2015年，國際血液學標準委員會（International Council for Standardization in Haematology，ICSH）根據十多位專家的研究和建議，推出了有關紅細胞形態術語的標準化和外周血細胞形態學特徵分級標準(ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell morphological features)，見表3。該項推薦標準對今後應用細胞形態術語的標準化，特別是在判斷細胞形態異常的標準方面，提供了有價值的借鑒性指導[6]。其中有關紅細胞形態的術語和分類原則，與我國專業書籍或教科書中有關紅細胞形態的命名及分類原創有一定差距，這方面應該引起我國同行們的注意。同時筆者也建議國內檢驗學會和血液學專家儘快討論，制定或建立中英文標準化術語和譯名，規範化各種細胞類別的定義，這對專業的發展是有積極意義的。
5、特別關注血小板，血小板體積小，易發生聚集和計數不準，因此是非常容易出現問題的複檢內容之一。在進行血塗片檢查或複檢時，首要注意是否出現血小板聚集（PLT Clump）報警信息，或者血小板分佈異常（PLT Abn Distribution）的提示，特別是應用EDTA抗凝血標本時，注意防範血小板假性減低現象發生。而EDTA抗凝劑導致的假性血小板減低會給臨床帶來誤診或延誤治療。
此外還需要關注大血小板是否明顯增加的報警（Large PLT），它會使阻抗法計數的血小板出現假性減低現象，此時需要考慮是否改用其他檢測原理的設備，或者改用顯微鏡計數法進行糾正，巨、大血小板出現過多甚至會導致儀器「漏數」，這些超出紅細胞體積大小的巨、大血小板只有通過鏡檢才能發現（圖13）。外周血出現較多顆粒缺失或減少的血小板、巨大血小板、形態異常的血小板、血小板體積明顯大小不等，對骨髓病態造血相關的疾病和凝血機能障礙的疾病具有提示意義，如骨髓增生異常綜合征、慢性骨髓增生性疾病等。
作者在最近的兩年中還發現了冷球蛋白血症患者，導致血小板計數假性升高的病例，如果是假性升高到極高的水平（如>1000×109/L）通過我們的複檢規則還可以發現，如果是血小板偏低，而假性升高到正常水平，甚至儀器不出現任何報警信息，那則是非常難以發現和複檢查出的，可間接通過鏡檢血塗片，注意發現紅細胞之間的不規則形的蛋白凝聚形成的凝固痕迹，同時評估血小板數量與儀器計數結果是否符合，如果不符合，特別是儀器計數結果顯著增高，可以懷疑為冷球蛋白現象的干擾。我們在2013和2015年就發現兩例此類患者。因此發現冷球蛋白血症，其血小板計數結果一定要經過人工複檢來確認，這是以前的複檢規則中未曾提到的問題[7]。
6、血片檢查中另一特別需要重視的問題是血液寄生蟲，某些患者可能因臨床癥狀不典型，未引起臨床醫生關注寄生蟲感染問題。我們在血液中可以發現瘧原蟲[8]、微絲蚴、巴貝斯蟲、錐蟲、弓形蟲等感染，要知道這些病原體的發現，實際上是給臨床出具了診斷性報告，是血液檢驗中可以發出確診報告的項目，這是非常重要的。如果臨床病人有相關癥狀，或臨床醫生提示檢查血液寄生蟲，應將血片仔細瀏覽，或者多塗幾張血片，包括厚血片進行細緻檢查。而目前在南方，特別是從疫區國家歸來的人員，其瘧原蟲感染率非常高，值得警惕和仔細檢查。
複檢有時候還需要傳統的顯微鏡法予以配合，雖然血細胞分析儀在計數的準確性、精密度上、檢測速度上已經大大高於傳統的人工測定方法，是毋庸置疑的。但是在某些特定的病例上，可能還需要人工法予以驗證和輔助分析。假如遇到EDTA及枸櫞酸鈉抗凝劑均可引發血小板聚集的病例，就需要回歸顯微鏡計數法。遇到嚴重的冷凝集現象或者冷球蛋白血症、紅細胞碎片增加的病例，都有可能導致紅細胞計數及血小板計數出現錯誤，都可能要回歸顯微鏡計數法予以解決。溶血性貧血患者過高的網織紅細胞，也可因儀器試劑或線性問題導致計數結果偏低或不正確，且在41條規則中並未涉及到此類問題的複檢規則，因此也需要用傳統的煌焦油藍染色和顯微鏡計數法予以糾正[9]。
重複和複查
在41條複檢規則中也多次提到重複和複查，並用重測標本、稀釋標本後重新測定、替代方法計數、按實驗室SOP進行等。這是觸發某條規則後，需要實驗室採用複查、稀釋標本複查或其他方法進行驗證與確認。
重測標本：當遇有相關問題時，可採用重測標本的方式確認，最好用另一台儀器，甚至另一品牌或不同原理的儀器進行重複，將有助於發現問題（前提是實驗室內儀器均應進行室內比對並符合比對要求）。稀釋標本後重新測定：當計數結果超出實驗室設定的線性範圍時，應採用稀釋後測定的方法獲得更加準確的結果。推薦用儀器配套的鞘液或稀釋液進行定量稀釋，記住稀釋比以便計算最終結果。
替代方法計數：實驗室應確認採用傳統計數方法對儀器不能準確測定的某些標本進行核實和計數。實驗室應該制訂適當的SOP，並準備適當的器材和試劑。作者建議實驗室內血小板稀釋液、白細胞稀釋液、煌焦油藍染液等應該是首選必備的試劑（圖17）。
圖像法設備的輔助複檢
目前已經有數字圖像的血細胞檢查系統，這些數字圖像設備甚至可以配置到血細胞分析儀流水線上，全自動運行。系統會按照實驗室制訂的複檢規則存入系統，當樣本觸發複檢規則後，設備可自動將血液運輸到塗片染色設備，製作一個標準的血塗片。再將血塗片置於自動顯微鏡下進行數字圖像拍攝，然後數字識別軟件對白細胞進行分類處理。其完全模擬顯微鏡分類技術進行形態學血細胞檢查，這是一個有益的進步。但是可能還有一些瓶頸問題尚未得到解決，或許因血細胞形態千變萬化，在原始和幼稚細胞、異常細胞形態等方面，在某些成分的干擾情況下，其正確識別率仍有待進一步的提升。
目前對應用此類儀器應用，作者的建議是，首先進行屏幕審核，糾正其錯誤識別的細胞，消除干擾成分，對難以鑒別的樣本，重新進行顯微鏡下的觀察和判別。
目前在廣泛應用各種品牌的自動化血細胞分析儀進行大量血常規標本檢測的背景下、在工作量增加、檢驗人員配備不足、檢驗報告時間被限定的現實條件下，制定適合自己實驗室使用的、能夠保證實驗質量、盡量減少漏檢和實驗誤差的複檢規則，非常重要。更為重要的是有了複檢規則、應該具體落實和執行這些規則，不要流於形式，以保證實驗室所出具的報告具有可信性和高質量，最大限度滿足臨床醫師診治工作對臨床檢驗的需求。
來源：檢驗視界網
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編輯：笪文武 審校：陳雪禮
