2024年首篇！劉如娟/施一公等團隊合作取得新進展

2024年1月2日，上海科技大學劉如娟、西湖大學施一公及聖裘德兒童醫院xu beisi等團隊合作在nucleic acids research 在線發表題為“thumpd2 catalyzes the n²-methylation of u6 snrna of the spliceosome catalytic center and regulates pre-mrna splicing and retinal degeneration ”的研究論文，該研究發現一種rna修飾-n²-甲基鳥苷(m²g)沉積在u6 snrna的g72上(剪接體的催化中心)，促進了人類細胞中有效的pre-mrna剪接活性。這種修飾在脊椎動物中被證實是保守的。

通過明確識別u6特異性序列和結構元件，thumpd2被證明是負責u6 m²g72的甲基轉移酶。敲除thumpd2消除了u6 m²g72，破壞了pre-mrna剪接活性，導致人類細胞中內源性pre-mrna的數千個可選剪接事件發生變化。值得注意的是，異常剪接的pre-mrna群體引發了無義介導的mrna衰變途徑。進一步表明，thumpd2與年齡相關性黃斑變性和視網膜功能有關。因此，該研究證明了主要剪接體的rna表觀遺傳修飾如何調節全局前mrna剪接並影響生理和疾病。

pre-mrna被稱為“剪接體”的巨rna-蛋白複合物剪接成成熟的mrna，在真核生物中起着關鍵作用。從酵母到哺乳動物，剪接事件的頻率從所有蛋白質編碼基因的約5%增加到約98%。在釀酒酵母的約6000個基因中大約有300個基因含有一個內含子，而在人類的約20,000個基因中平均含有8個內含子。有趣的是，大量的生化和結構研究表明，剪接體的整體組織和剪接催化核的結構在人類和酵母之間是非常保守的。因此，在高等真核生物中大量的剪接事件對剪接體的操作能力提出了挑戰，但確切的潛在機制尚不清楚。

剪接體是一種在pre-mrna上動態重新形成的蛋白質協調核酶，涉及5種保守的小核rna(snrna)：u1, u2, u4, u5和u6，具有多種蛋白質。snrna催化pre-mrna剪接，而u6位於剪接體的催化核心。u6的內部莖環(internal stem-loop,isl)是剪接催化中心的主要組成部分。在pre-mrna剪接過程中，催化核的核苷酸與兩個催化金屬離子螯合以完成分支和外顯子連接。

rna修飾在各種生物事件中起着關鍵的調節作用。在高等真核生物中，u6在轉錄後被大量修飾，在多個位點檢測到假尿嘧啶(ψ)和2'-o-甲基化(nm)，並檢測到兩個單獨的n⁶-甲基腺苷(m⁶a，人類u6的核苷43)和n²-甲基鳥苷(m²g，人類u6的核苷72)。u6的ψ和nm主要分別由box c/d snornp (dyskerin)和box h/aca snornp(fibrarin)引入，可能增加了u6中的鹼基堆疊和鹼基配對。最近，發現u6 m⁶a被mettl16甲基化，對識別5 '剪接位點(5 ' s)至關重要。然而，唯一的另一個鹼基甲基化(m²g72)的作用仍然難以捉摸。

文章模式圖（圖源自nucleic acids research）

g72是一個保守的催化活性位點，存在於從酵母(g78)到人類的各種生物中。人類主剪接體的結構表明，isl的g72(酵母中的g78)參與剪接體活化催化中心的形成，並直接與催化金屬離子m1結合。在剪接催化的雙金屬離子模型中，人u6-g72、-u74和pre-mrna提供sp磷酸氧結合兩個金屬離子，與5 ' ss鳥苷的磷酸結合去除內含子。在一些哺乳動物的u6序列中，可以鑒定出g72上的m²g修飾。儘管這種修飾在40年前首次被發現，但其對前mrna剪接的影響及其生理作用仍不清楚。

本研究表明，m²g72存在於斑馬魚、小鼠和人類的u6中，但不存在於u6atac中(u6在次要剪接體中的功能類似物)。利用反向遺傳學方法結合rna-質譜法，該研究發現thump結構域蛋白2(thumpd2)是負責修飾的甲基轉移酶。thumpd2與一個輔助蛋白，一個多功能甲基轉移酶亞基trm112樣蛋白(trmt112)相互作用，催化u6 m²g72。體外pre-mrna剪接實驗表明，u6 m²g72缺失降低了剪接體的剪接活性。thumpd2的缺失導致數千個選擇性剪接(as)事件的改變，並上調無義介導的mrna衰變(nmd)途徑。最近的全基因組關聯研究(gwas)發現了與年齡相關性黃斑變性(amd)相關的thumpd2基因變異。本研究發現，約50個已報道的amd相關基因和另外30個具有視網膜特異性功能的基因的pre-mrna是thumpd2介導的剪接調控的直接靶點，提示thumpd2在amd發病機制中的作用。